La Replicazione del DNA

Eccoci qua con una nuova dispensa.

Pronto per iniziare?

Bene, allora partiamo.

Ma esattamente di cosa parliamo?

Della duplicazione del DNA, come avrai capito dal titolo di questo articolo! Processo essenziale nella vita di una cellula e per i meccanismi dell’ereditarietà. Basti pensare che il genoma non potrebbe essere ereditato da una cellula all’altra o da un genitore a un figlio se il DNA non fosse in grado di duplicarsi (se proprio vogliamo essere pignoli non è il DNA che si duplica, ma viene duplicato da un insieme di enzimi).

Piccola parentesi alla Super Quark: quando Watson e Crick si misero a studiare la doppia elica di DNA si accorsero che la sua struttura era tale per cui necessariamente la molecola doveva duplicarsi. Ma alt, facciamo le cose con ordine.

Prima di cominciare però dobbiamo introdurre un paio di cose sul DNA:

  1. Il DNA è una molecola costituita da due filamenti formati da sequenze di nucleotidi
  2. I due filamenti si dispongo fra loro a formare una doppia elica destrogira e antiparallela (che paroloni, semplifichiamo. Destrogira ci ricorda che l’elica gira verso destra e antiparallela beh, lo vedremo dopo)
  3. Ma, ci ricordiamo qual è il monomero che va a costituire il DNA? Il nucleotide! Se non lo ricordi, un nucleotide si compone di un gruppo fosfato e un nucleoside, composto a sua volta da uno zucchero pentoso, il desossiribosio, e una base azotata, che può essere Timina, Guanina, Adenina o Citosina.Nel nucleotide vediamo un legame fosfodiestere fra il gruppo fosfato e il desossiribosio, a livello del carbonio 5, e un altro legame fosfodiestere fra il carbonio 3 dello zucchero e il gruppo fosfato del nucleotide successivo.Si forma quindi uno scheletro sostituito da una successione di zucchero e fosfato, in cui il fosfato lega il 5’ dello zucchero e il 3’ dello zucchero lega il fosfato successivo, a sua volta questo fosfato legherà il 5’ dello zucchero e così via. Diciamo che è per questo che il filamento di DNA va letto in direzione 5’-3’. Non dimenticarlo! Da 5’ a 3’.

Bene, adesso iniziamo a parlare di duplicazione.

Innanzitutto, per poter fare una copia del DNA dobbiamo poter avere accesso alla doppia elica e alla sequenza di basi azotate, dato che l’obiettivo di questo procedimento sarà quello di “produrre” dalla nostra doppia elica, due doppie eliche che contengano la stessa sequenza di nucleotidi.

Per fare questo dovremmo aprire la doppia elica e così i due filamenti fungeranno da stampo per poter generare due filamenti complementari ( si dice che la duplicazione è semiconservativa perché ognuna delle due eliche fungerà da stampo per sintetizzare il filamento complementare e otterremo due molecole di DNA ciascuna contenente un filamento stampo e uno complementare), in assoluto rispetto alla regola della complementarietà delle basi azotate. Ovvero? La Timina lega l’Adenina e la Guanina lega la Citosina.

Per poter aprire la doppia elica interviene un enzima detto DNA Elicasi, questo enzima è in grado di inserirsi nella doppia elica e rompere i legami idrogeno che tengono unite le basi azotate complementari.

L’enzima, per poter svolgere questa funzione, ha bisogno di energia e la ricava dall’idrolisi dell’ATP, la molecola energetica per eccellenza nella cellula.

Piccola chicca: l’enzima elicasi è composto da più pezzi, chiamati subunità; alcune di queste subunità hanno il compito di idrolizzare ATP e favorire il cambiamento di conformazione della proteina, cambiando forma, la proteina, che si era intrufolata nella catena, spezza i ponti idrogeno. È così la nostra elica si apre e vengono esposte le basi azotate, che qualcuno si dovrà prendere la briga di appaiare con le proprie complementari.

Però facciamo un piccolo passo indietro, manco fossimo Amadeus.

Un singolo filamento di DNA è lungo circa 1,20 m, dunque dove si va a piazzare l’Elicasi?

L’enzima si potrebbe posizionare agli estremi della molecola, ma non sarebbe conveniente dato che potrei duplicare solo in due direzioni; allora l’enzima si pone in mezzo alla molecola per poter permettere di avere più origini di duplicazione.

Una volta che la nostra elicasi si piazza, inizia a svolgere la doppia elica e origina quella che si chiama bolla di duplicazione. All’interno di questa bolla di duplicazione noi abbiamo due direzioni verso le quali possiamo andare a duplicare, le due direzioni iniziano in un punto detto forcella di duplicazione.

Ma un attimo.

Se ho due forcelle di duplicazione, l’elicasi dove si dispone? Su entrambe!

Abbiamo due elicasi, che vanno ad aprire l’elica nelle due forcelle di replicazione, ma dato che vanno a svolgere la stessa attività ci concentreremo solo su una delle due.

Abbiamo quindi aperto la doppia elica. Ora dobbiamo fare in modo che i due filamenti, essendo complementari e molto vicini fra loro, non si riuniscano. Intervengono allora delle proteine, dette SSB proteins (single strend binding proteins), che impediscono alla doppia elica di richiudersi. Abbiamo però un altro problema.

L’elicasi mentre avanza origina degli aggrovigliamenti nella molecola che non è in grado di risolvere; cosa faccio?

Se l’elicasi continua ad andare avanti e se si è formato un groviglio nell’elica, cercando di aprirla l’elicasi non fa altro che aumentare la te

nsione meccanica rischiando di rompere la molecola.

Per capire questo concetto prendi un elastico, attorciglialo proprio come se fosse un doppio filamento di DNA e ora aprilo al centro: vedi che si formano dei superavvolgimenti ai lati del tuo elastico? Questo è quello a cui mi riferisco.

Allora per risolvere il problema int

erviene un enzima che si chiama topoisomerasi. Invece quello che abbiamo definito come “groviglio”, correttamente si definisce superavvolgimento.

Risolti i problemi creati dall’elicasi possiamo iniziare a duplicare il DNA.

Per far questo interviene l’enzima principale del processo che si chiama DNA polimerasi. Questo enzima sintetizza il nuovo filamento di DNA in

direzione 5’-3’, ovvero posiziona un nucleotide in modo che si attacchi a un nucleotide già posizionato, che ha l’estremità sul 3’ libera.

Quindi si posizionerà a livello di un 3’ libero e li andrà ad attaccare nuovi nucleotidi. Chiaramente se sintetizza in direzione 5’-3’ e dato che i filamenti devono essere antiparalleli, sulla catena che funge da stampo leggerà i nucleotidi dal 3’ al 5’.

La polimerasi quindi legge il nucleotide sulla catena stampo e posiziona il complementare andando a formare dei legami fosfodiestere fra il nucleotide già presente sulla catena e quello che deve aggiungere.

Ti ricordo che il legame si va a formare fra lo zucchero e il fosfato.

La DNA polimerasi, però ha una duplice funzione: infatti può capitare che sbagli a posizionare un nucleotide per discolpare l’enzima, capita che posizioni un nucleotide errato perché inseguito a certi processi il “nucleotide stampo” può essere mutato), allora può fare un’attività di correzione di bozze (la cosiddetta attività di proofreading), ovvero può tornare indietro e sostituire il nucleotide che ha inserito in modo errato.

Quest’attività si chiama esonucleasica.

Però c’è un problema: la DNA polimerasi non può iniziare ad attaccare nucleotidi da zero, deve attaccarsi a una sequenza già sintetizzata. Perché?

Pensiamo per assurdo che la polimerasi inizi da zero, mette il primo nucleotide e se questo fosse sbagliato con la sua attività esonucleasica lo può togliere, ma così rimarrebbe senza nulla in mano. Allora dovrebbe iniziare usando un enzima che non abbia un’attività esonucleasica.

Uso allora una RNA polimerasi, un enzima che aggiunge ribonucleotidi. I pochi nucleotidi aggiunti fanno parte di una breve sequenza detta primer, al quale la DNA polimerasi si attaccherà per sintetizzare nuovo DNA.

In questo processo però si viene a creare un problema (sì lo so, parlo solo di problemi): la DNA polimerasi sintetizza in direzione 5’-3’, per tanto solo una delle due polimerasi seguirà la direzione di apertura della molecola, ovvero la direzione dell’elicasi, l’altra polimerasi dovendo sempre sintetizzare in 5’-3’ dovrà andare nella direzione opposta all’elicasi.

Cosa succede allora?

La DNA polimerasi che segue l’elicasi può sintetizzare senza problemi dato che segue l’elicasi sintetizzerà in modo continuo e veloce.

L’altra polimerasi ha però dei problemi, innanzitutto andando in direzione opposta all’elicasi è in ritardo: partendo da un punto va nella direzione opposta rispetto alla forcella di replicazione, quindi poi dovrà tornare indietro e sintetizzare il tratto di DNA che si è lasciata indietro.

Pertanto, la DNA polimerasi che va in direzione opposta rispetto all’elicasi sintetizzerà in modo discontinuo e chiaramente più lento. In più, cosa succede?

Ogni volta che va a ritroso la DNA polimerasi non trova un nucleotide con un estremo 3’ a cui agganciarsi per polimerizzare, allora dovrà necessariamente intervenire la RNA polimerasi, che ogni volta dovrà sintetizzare un primer.

Dato che i due filamenti lavorano in modo diverso, gli scienziati hanno attribuito loro nomi diversi: il filamento sintetizzato in maniera continua viene definito filamento veloce, o se sei anglofone (che non è un insulto, ci tengo a specificare), “leading strand” e il filamento lento “lagging strend”.

Piccola chicca: Dato che le due polimerasi vanno a velocità diverse, vanno ognuna per la propria strada o si aspettano a vicenda? Questo non è necessario che tu lo sappia ai fini dei test, però le due DNA polimerasi sono unite da una struttura detta subunità tau e le due polimerasi agiscono secondo un meccanismo che viene definito “modello a trombone” che permette loro di “aspettarsi” a vicenda, se sei curioso ti consiglio di andare a profondire perchè è veramente incredibile quello che c’è dietro tutto il meccanismo.

Bene abbiamo concluso con la duplicazione, o forse non del tutto.

Ci siamo dimenticati una cosa!

Sul filamento lento abbiamo dopo la sintesi dei frammenti di RNA e dei frammenti di DNA, questi ultimi sono chiamati frammenti di Okazaki, dal nome dello scienziato che li ha scoperti, ma a parte quest’altra parentesi alla Super Quark, ti faccio una domanda:

Possiamo avere un filamento con tratti di DNA e di RNA sconnessi fra loro?

No, assolutamente.

Allora interviene una esonucleasi che rimuove i primer e un’altra DNA polimerasi, non quelle due impegnate nella sintesi, si occupa di inserire i tratti di DNA mancanti; in questo caso serve un primer? Fortunatamente no, la polimerasi troverà sempre un’estremità 3’ a cui attaccarsi per sintetizzare il DNA. Per finire poi interviene la ligasi che lega fra loro i frammenti di Okazaki.

Ed ecco che il processo di duplicazione è concluso, però ci resta da ragionare su un ultima cosa (ti prometto che è l’ultima).

Se andiamo infatti a vedere le estremità dei due filamenti ci accorgeremo che dopo la rimozione dei primer, rimarranno dei buchi.

Purtroppo, qua non può intervenire nessuna DNA polimerasi dato che non ha l’aggancio per sintetizzare; e allora?

Le estremità vengono perse.

Perdiamo dei pezzi di DNA?!

Eh già, le estremità dei cromosomi, che non sono altro che la forma massima di organizzazione del DNA, prendono il nome di telomeri e contengono sequenze ripetute non codificanti che possono essere perse senza per dare delle informazioni genetiche.

I telomeri hanno quindi un ruolo importantissimo, dato che nel momento che i telomeri si esauriscono la cellula non può più duplicare il genoma e muore. Sono una sorta di clessidra per la cellula. All’incirca ogni cellula si può duplicare fra le 40 e le 50 volte.

Ma attenzione attenzione: ci sono delle cellule che ovviano a questo problema e che quindi sono in grado di ripristinare i telomeri. Queste cellule possono potenzialmente duplicarsi all’infinito dato che non esauriranno mai i propri telomeri.

Le cellule in questione sono le cellule staminali e le cellule tumorali.

Queste cellule infatti possiedono un enzima chiamato telomerasi. Al suo interno contiene uno stampo di RNA che serve a prolungare la catena di DNA, su questo stampo agisce infatti una specifica DNA polimerasi.

E’ tutto, è stato un piacere intrattenerti.

Ma non vorrei mai lasciarti senza studio, quindi ti ricordo che abbiamo trattato in altre due dispense le due fasi successive alla replicazione del DNA: la trascrizione e la sintesi proteica.

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